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Nature Communications 13권, 기사 번호: 2919(2022) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

유전적으로 암호화된 형광 바이오센서는 온전한 생물학적 시스템에서 화학적 과정을 추적하는 데 사용되는 강력한 도구입니다. 그러나 바이오센서의 개발과 최적화는 후보 바이오센서를 스크리닝하는 방법의 기술적 한계로 인해 여전히 어렵고 노동 집약적인 과정으로 남아 있습니다. 여기에서는 스크리닝 처리량의 크기 증가를 제공하기 위해 액적 미세 유체와 자동화된 형광 이미징을 결합하는 스크리닝 양식에 대해 설명합니다. 더욱이, 한 번에 단일 바이오센서 기능(예: 밝기)을 스크리닝하는 것으로 제한되는 현재 기술과 달리, 우리의 방법은 여러 기능(예: 대비, 친화성, 특이성)을 병렬로 평가할 수 있습니다. 바이오센서 기능은 공변할 수 있으므로 이 기능은 신속한 최적화에 필수적입니다. 우리는 이 시스템을 사용하여 세포내 젖산염 농도를 정량화하는 데 사용할 수 있는 젖산염용 고성능 바이오센서를 생성합니다. LiLac이라는 이름의 이 바이오센서는 대사산물 감지 분야에서 상당한 발전을 이루었으며 우리의 스크리닝 접근 방식의 강력함을 보여줍니다.

유전적으로 암호화된 형광 바이오센서는 신진대사를 연구하는 데 중요한 도구입니다. 이들의 형광 신호는 빠른 시간 척도와 만성 이미징 중에 높은 시간적 해상도를 제공하며 유전적으로 인코딩되어 있기 때문에 살아있는 세포에서 직접 발현되고 특정 세포 유형 및 세포 소기관을 표적으로 삼을 수 있습니다6,7 . 단일 세포는 대사적으로 구별될 수 있고 대사산물은 빠른 속도로 전환되므로 바이오센서는 도전이나 자극에 반응하여 기준 대사 상태와 대사 교란의 개별 세포에서 고유한 정확한 측정을 가능하게 했습니다.

대사산물 농도를 정량화하려면 형광 바이오센서의 판독값이 i) 표적 리간드의 생리학적 농도에 맞춰 조정되어야 하고, ii) 해당 리간드에 대해 매우 특이적이고, iii) 세포 환경(pH 포함) 및 발현 수준의 변화에 대해 견고해야 합니다. 바이오센서 자체. 이러한 고성능 바이오센서를 개발하는 유일한 방법은 많은 리간드 농도 및 조건에 노출될 때 대형 바이오센서 라이브러리에서 많은 개별 변이체를 분석하여 이를 선별하는 것입니다.

이는 바이오센서 스크리닝에 대한 과제를 제기합니다. 진화하는 형광 단백질 및 바이오센서7,11,12,13,14를 위한 새로운 플랫폼 엔지니어링의 인상적인 발전에도 불구하고 기존 스크린은 바이오센서에 대해 테스트할 수 있는 조건 수가 여전히 제한되어 있습니다. 여기서 우리는 액적 미세유체와 자동화된 2광자 형광 수명 이미징(2p-FLIM)을 결합하여 스크리닝 콘텐츠와 처리량을 수십 배로 증가시켜 이러한 한계를 극복했습니다. 형광 수명은 광자 흡수와 광자 방출 사이의 평균 시간이며, 수명 센서는 손상되지 않은 세포7,15,16에서 소분자 수준을 정량화하기 위한 고성능 도구로 등장했습니다. 여기에서 우리는 미세 투석 챔버 역할을 하는 겔-쉘 비드(GSB)17라고 불리는 미세 유체로 생성된 반투과성 젤을 활용하여 다양한 조건에 대해 독립적으로 격리된 수천 개의 수명 센서 변형을 분석하는 동시에 친화도, 특이성 및 반응을 평가했습니다. 크기.

또한 당사의 스크리닝 시스템인 BeadScan을 사용하여 유전적으로 암호화된 형광 바이오센서를 신속하게 개발하고 최적화할 수 있는 방법도 보여줍니다. 스크린 기능을 시연하기 위해 BeadScan을 사용하여 LiLac이라는 이름의 젖산염에 대한 고성능 수명 센서를 생성했습니다. 젖산은 최근 혈액에서 순환하는 주요 세포 연료, 세포와 조직 전체에 걸쳐 산화환원 상태를 전달하는 수단, 특정 유형의 암에 선호되는 연료로 평가되는 해당과정의 핵심 산물입니다18,19,20. 기존 젖산염 바이오센서는 뇌와 암세포의 대사를 조사하는 데 사용되어 왔지만21,22,23,24,25,26 각각 정량화를 어렵게 만드는 한계가 있습니다(예: 젖산염의 생리학적 변화에 대한 약한 민감성 또는 칼슘에 대한 바람직하지 않은 반응). 및/또는 pH). LiLac은 큰 반응 크기(포유류 세포에서 1.2ns 수명 변화 및 > 40% 강도 변화), 생리적 [젖산]에 대한 특이성, 칼슘에 대한 저항성 또는 pH 변화를 나타냅니다. 또한 LiLac 수명 반응은 매우 정확하고 정규화가 필요하지 않아 살아있는 세포의 젖산염 농도 정량을 용이하게 합니다. 따라서 LiLac은 단일 세포 수준에서 대사를 연구하기 위한 강력한 도구를 구성하며 우리의 스크리닝 접근 방식의 장점을 보여줍니다.

80% efficiency) as they pass a localized field generated by an electrode (10 kHz, 0.5 kV), at which point the amplified DNA is captured by the beads. c Addition of perfluorooctanol (PFO) breaks the emulsion, which separates into an aqueous phase containing the beads and an oil phase. The beads are then washed to eliminate residual unbound DNA. d The library of DNA beads is re-encapsulated in new droplets along with in vitro transcription/translation (IVTT) reagents using a custom microfluidic device that combines the two aqueous streams immediately prior to emulsification, mitigating premature transcription and mRNA cross-contamination. Only droplets containing a DNA bead will express fluorescent biosensor protein following an overnight incubation at 30 °C. e Finally, IVTT droplets are converted into durable semipermeable GSBs by controlled microfluidic merging with a mixture of agarose (gel in sol) and alginate (polyanion), followed by emulsion breakage by PFO in the presence of PAH (polycation). The two polyelectrolytes form a semipermeable shell at the surface of the gel scaffold, trapping proteins and DNA inside the gel but allowing small molecules (<2 kDa) to pass through17. Continuous exchange of ligands allows for the collection of full dose-response curves from the biosensor protein encapsulated in each gel during downstream screening. Scale bars represent 20 μm./p>200,000 clonal copies of >2 kb amplicons, and millions of beads can be prepared in parallel. However, optimal expression of soluble sensor protein was achieved with beads intentionally limited to ~100,000 copies of DNA by pre-blocking a subset of streptavidin binding sites, because more densely loaded beads sometimes led to the accumulation of visible protein aggregates within the droplet (Suppl. Fig. 1c). We also optimized the concentration of biotinylated 3’ primer included in the emPCR droplets. We found that using an excess of biotinylated 3’ primer led to poor results, presumably because the unextended original biotinylated 3’ primer competes with fully-extended biotinylated DNA for streptavidin binding sites. Therefore, we used a limiting concentration of the 3’ primer to ensure the complete extension of all biotinylated primer molecules, so that only fully extended amplicons are captured on the streptavidin beads./p>20 mL/min flow rates within a standard microscopy perfusion chamber, allowing rapid exchange of external conditions while fluorescence responses from the encapsulated biosensors are recorded using 2p-FLIM. After screening, single GSBs are retrieved with a microcapillary and DNA sequences are recovered by PCR amplification and Sanger sequencing (Suppl. Fig. 3)./p>5-fold reduced variability, and substantially higher signal to noise ratio (LiLacSNR ~ 25, Laconicdonor lifetime,SNR < 1; Suppl. Fig. 6a–c). Here, the SNR metric estimates the change in lifetime signal in cells from 0 to 10 mM external lactate relative to the average noise level at each condition. We also observed that the lifetime of the Laconic donor species varies widely across cells bathed in lactate (Suppl. Fig. 6b–c), as also observed with its FRET signal23. By comparison, the high precision of the LiLac readout suggests that the cell-to-cell variability observed with Laconic may be an artifact of the biosensor. While the source of this variability is undetermined, recent evidence suggests that Laconic may be partially degraded in cells, producing some fluorescence signal that is uncoupled from lactate binding23./p>40% (Suppl. Fig. 7), which is comparable to that of the most sensitive intensity-based lactate biosensor23, but with the added benefit of substantial pH resistance. Therefore, LiLac can also be used as an intensiometric biosensor, although additional normalization would be required for the quantitative determination of lactate levels./p>200,000 clonal copies of >2 kb dsDNA per 6 μm bead. Existing methods that immobilize primers on a bead and then amplify from the bead surface (e.g. BEAMing) are limited to ~1000 copies/bead for comparably sized amplicons and beads27,28. We presume that molecular crowding constraints at the bead surface limit amplification efficiency, while our method circumvents this problem by allowing the template DNA to be amplified in free solution in the droplet before immobilization on beads. This advance combined with optimization of the reaction conditions within the droplets allowed us to achieve micromolar expression levels of unique biosensor protein variants in IVTT droplets and subsequent GSBs./p>

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